空间转录组测序

基因表达具有时间和空间的特异性。通过对不同时间点和部位的样本取材，使用单细胞转录组测序技术能够解析时间维度上细胞类型和基因表达的变化过程。然而单细胞测序实验的前提是组织必须通过机械分离或酶解消化成单细胞悬液，此过程不可避免地丢失了组织中细胞所处的原始位置信息，也导致了细胞间的通讯网络被打破，这使我们难以获得组织中不同区域的细胞构成和基因表达状态，以及不同功能区之间的基因差异表达等信息。现有的原位表达图谱主要是通过报告基因或原位杂交等技术来实现，但是这些方法实现比较困难，并且通量低，限制了多样本、高时效的应用。而空间转录组技术则可以高效地检测组织中空间原始位置上的基因表达模式。

图1.空间转录组测序技术蓬勃发展

空间转录组（Spatial Transcriptomics）就是将基因的表达情况与关注的组织切片的免疫化学染色图像进行整合，从而将组织内不同细胞的基因表达信息定位到组织的原始空间位置上去，进而直接观测组织中不同部位功能区基因表达的差异。空间转录组利用了常规的原位技术和组学技术两方面的优势，结合了芯片与高通量测序的核心概念。

   1.技术优势

①　平台稳定：不需要单细胞解离，组织切片即可；

②　周期短：从样本处理到建库仅需一天；

③　可视化：Space Ranger可视化数据分析；

④　空间定位：结合scRNA-seq可实现基因空间定位；

⑤　兼容性强：人、小鼠、大鼠组织；新鲜冷冻样品和石蜡样本均可；

⑥　应用领域广：肿瘤异质性、免疫浸润、空间发育图谱构建、神经疾病特征、病理基因表达区域鉴定等；

 2.技术原理

将冷冻组织切片放置在10X Genomics Visium芯片的捕获区域内，进行HE染色和成像后，对组织切片进行透化处理，细胞内的mRNA因而释放，从而被芯片上带有oligo-dT的探针捕获。并且，每个探针都带有特异的位置信息（Spatial Barcode），然后以mRNA为模版进行cDNA合成，构建文库后再测序。测序获得基因表达信息的同时，每一条测序reads因带有Spatial Barcode，进行对比即可获得基因表达的位置信息。

图2.空间转录组整体实验流程

10X Genomics Visium技术包含两种芯片，分别为组织优化芯片（Tissue Optimization）和基因表达芯片（Library Preparation）。组织优化芯片用来摸索组织透化的最佳时间，基因表达芯片用来进行正式样本的空间转录组实验。其中基因表达芯片上有4个捕获区域，每个区域大小为6.5 mm×6.5 mm，每个捕获区域中含5,000个带有特异空间序列的探针簇。称为Barcoded Spots。每个spot直径为55 μm，包含数百万个用于捕获的oligo探针序列，相邻两个spots的中心距离为100 μm。探针序列的结构依次为：测序引物结合序列，16 nt的位置序列，12 nt的UMI序列，以及30 nt的oligo-dT序列。

图3.空间转录组芯片构成

 

3.联合单细胞测序解析细胞类型的空间位置信息

空间转录组测序可以获得不同基因在组织切片上的空间位置信息，但不能获得详细的细胞类群信息（因为空间转录组不是单细胞分辨率，它以spot为单位进行分辨，只能粗略地分析切片上不同位置的细胞类型）。因此，需要借助单细胞测序数据来分析细胞类型，然后通过生物信息学的分析方法将单细胞类群映射到空间转录组数据上。

选择已有的对应物种、组织的细胞类型注释数据作为参考库。基于单细胞测序得到的不同类群的Marker Gene，选择参考数据库中不同细胞类型间高度变化的基因，然后计算预测的spot与参考数据库的相关性，通过不断剔除相关性最差的类型以循环计算相关性，最终得到预测spot的细胞类型注释。

图4.MIA(Multimodal intersection analysis)